シーケンス

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遺伝学および生化学シーケンシングを決定するための手段の一次構造を非分枝状の(時には誤って一次配列と呼ばれる)バイオポリマー。知られているシンボリック線形描写で結果を配列決定配列簡潔配列決定分子の原子レベルの構造の多くをまとめたものです。

DNAシーケンスは、特定のDNAフラグメントのヌクレオチド順序を決定するプロセスです。これまでのところ、ほとんどのDNAシーケンスは、FrederickSangerによって開発されたチェーンターミネーション法を使用して実行されてきました。この技術は、修飾ヌクレオチド基質を使用したDNA合成反応の配列特異的終結を使用します。ただし、パイロシーケンスなどの新しいシーケンス技術は、シーケンス市場でますますシェアを獲得しています。現在、サンガーDNAシーケンスよりも多くのゲノムデータがパイロシーケンスによって生成されています。パイロシーケンスにより、迅速なゲノムシーケンスが可能になりました。細菌ゲノムは、この手法で数回のカバレッジで1回の実行でシーケンスできます。この手法は、最近、ジェームズワトソンのゲノムの配列決定にも使用されました。[1]

DNAの配列は、生物が生き残り、繁殖するために必要な情報をエンコードします。したがって、シーケンスを決定することは、生物が生きる理由と方法に関する基礎研究、および応用対象において有用です。DNAは生物にとって非常に重要であるため、DNA配列の知識は、生物学研究の実質的にあらゆる分野で役立ちます。たとえば、医学では、遺伝病の特定、診断、および治療法の開発に使用できます。同様に、病原体の研究は伝染病の治療につながる可能があります。バイオテクノロジーは急成長している分野であり、多くの有用な製品やサービスの可能性があります。

カールソン曲線は、エコノミスト [2]によって造られた用語で、ムーアの法則の生物工学的同等物を説明し、著者のロブカールソンにちなんで名付けられました。[3] Carlsonは、DNAシーケンシングテクノロジーの倍加時間(コストとパフォーマンスで測定)が少なくともムーアの法則と同じくらい速いと正確に予測しました。[4]カールソン曲線は、DNA配列決定、DNA合成、タンパク質発現やタンパク質発現に使用されるさまざまな物理ツールや計算ツールなど、さまざまなテクノロジーのコストの急速な(場合によっては超指数関数的な)減少とパフォーマンスの向上を示しています。タンパク質構造の決定。

サンガーシーケンシング

放射性標識シーケンシングゲルの一部

チェーンターミネーターシーケンシング(サンガーシーケンシング)では、テンプレートDNAの特定の部位で、その領域のテンプレートに相補的な短いオリゴヌクレオチド「プライマー」を使用して伸長を開始します。オリゴヌクレオチドプライマーは、DNAを複製する酵素であるDNAポリメラーゼを使用して拡張されます。プライマーとDNAポリメラーゼには、4つのデオキシヌクレオチド塩基(DNAビルディングブロック)と、低濃度の鎖末端ヌクレオチド(最も一般的にはジデオキシヌクレオチド)が含まれています。デオキシヌクレオチドは、リボース分子の2 'および3'位置の両方でOH基を欠いているため、DNA分子内に挿入されると、それがさらに伸長するのを防ぎます。このシーケンサーでは、4つの異なる容器が使用され、それぞれに4つのジデオキシリボヌクレオチドのみが含まれています。DNAポリメラーゼによるランダムな位置での鎖終結ヌクレオチドの取り込みは、所与のジデオキシリボヌクレオチドで終結する、異なるサイズの一連の関連するDNAフラグメントをもたらす。次に、フラグメントは、スラブポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって、またはより一般的には、粘性ポリマーで満たされた細いガラス管(毛細管)でサイズ分離されます。

例の色素ターミネーター読み取りの開始のビュー(クリックして展開)

プライマーの標識に代わる方法は、代わりにターミネーターに標識を付けることです。これは一般に「色素ターミネーターシーケンシング」と呼ばれます。このアプローチの主な利点は、ラベル付きプライマーアプローチで必要な4つではなく、単一の反応で完全なシーケンスセットを実行できることです。これは、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーターのそれぞれを、異なる波長で蛍光を発する別個の蛍光色素で標識することによって達成されます。この方法は、色素プライマーアプローチよりも簡単で迅速ですが、大きな色素鎖ターミネーターの組み込みにおけるテンプレート依存の違いにより、より不均一なデータピーク(異なる高さ)を生成する可能性があります。この問題は、取り込みのばらつきを最小限に抑える新しい酵素と色素の導入により大幅に軽減されました。この方法は、より簡単で安価であるため、現在、シーケンス反応の大部分に使用されています。これの主な理由は、プライマーを個別にラベル付けする必要がないことです(これは、シングルユースのカスタムプライマーではかなりの費用がかかる可能性があります)が、頻繁に使用される「ユニバーサル」プライマーではそれほど問題にはなりません。これは、イルミナ、454、ABI、ヘリコス、ドーバーの第2世代および第3世代システムの費用対効果の向上により急速に変化しています。

パイロシーケンス

パイロシーケンシング法は、ヌクレオチド取り込み時のピロリン酸放出の検出に基づいています。パイロシーケンスを実行する前に、シーケンスするDNA鎖をPCRで増幅する必要があります。次に、ヌクレオチドをシーケンサーに追加する必要がある順序が選択されます(つまり、GATC)。特定のヌクレオチドが追加されると、DNAポリメラーゼがそれを成長鎖に組み込むと、ピロリン酸が放出され、ATPスルフリラーゼによってATPに変換されます。ATPはルシフェラーゼを介してルシ​​フェラーゼの酸化を促進します。この反応により、パイログラムピークとして記録された光信号が生成されます。このようにして、ヌクレオチドの取り込みはシグナルと相関します。光信号は、DNA鎖の合成中に組み込まれたヌクレオチドの量に比例します(つまり、組み込まれた2つのヌクレオチドは2つのパイログラムピークに対応します)。追加されたヌクレオチドがDNA分子に組み込まれていない場合、シグナルは記録されません。酵素アピラーゼは、反応に残っている組み込まれていないヌクレオチドをすべて除去します。この方法では、蛍光標識ヌクレオチドもゲル電気泳動も必要ありません。PålNyrénとMostafaRonaghi DNAによって開発されたパイロシーケンスは、Biotage(低スループットシーケンス用)と454 Life Sciences(高スループットシーケンス用)によって商品化されました。後者のプラットフォームは、1台のマシンで7時間実行すると、約100メガベース(現在は最大400メガベース)のシーケンスを実行します。アレイベースの方法(454 Life Sciencesによって商業化されている)では、一本鎖DNAがビーズにアニーリングされ、EmPCRを介して増幅されます。次に、これらのDNA結合ビーズは、ATPの存在下で光を生成する酵素とともに光ファイバーチップ上のウェルに配置されます。遊離ヌクレオチドがこのチップ上で洗浄されると、ヌクレオチドがそれらの相補的な塩基対と結合するときにATPが生成されるため、光が生成されます。1つ(または複数)のヌクレオチドを追加すると、反応が起こり、光信号が生成されます。この光信号は、機器のCCDカメラによって記録されます。信号強度は、単一のヌクレオチドフローに組み込まれたヌクレオチドの数、たとえばホモポリマーストレッチに比例します。[1]

真の単一分子シーケンシング

大規模なシーケンス

上記の方法はさまざまなシーケンス方法を説明していますが、ゲノムの大部分がシーケンスされる場合は、個別の関連用語が使用されます。エクソームシーケンシング(遺伝子をコードするすべての染色体にわたるすべてのDNAのサブセット)または全ゲノムシーケンシング(ヒトのすべての核DNAのシーケンシング)を実行するために、いくつかのプラットフォームが開発されました。

RNAは細胞内での安定が低く、実験的にヌクレアーゼ攻撃を受けやすい傾向があります。RNAはDNAからの転写によって生成されるため、情報はすでに細胞のDNAに存在しています。ただし、RNA分子の配列決定することが望ましい場合もあります。DNAの配列決定は生物の遺伝的プロファイルを提供しますが、RNAの配列決定は細胞内で活発に発現している配列のみを反映します。RNAの配列を決定するための通常の方法は、最初にサンプルから抽出したRNAを逆転写してcDNAフラグメントを生成することです。次に、これを上記のように順序付けることができます。細胞で発現するRNAの大部分は、リボソームRNAまたは低分子RNAであり、細胞の翻訳に有害ですが、多くの場合、研究の焦点では​​ありません。この画分はinvitroで除去できますが、通常関心のあるメッセンジャーRNAも含まれています。エクソンに由来するこれらのmRNAは、後で特定の細胞機能をサポートするタンパク質に翻訳されます。発現プロファイルは、したがって、特に疾患の研究、細胞の挙動、試薬または刺激に対する応答に所望の細胞活性を示しています。イントロンが切除されるため、真核生物のRNA分子は必ずしもDNAテンプレートと同一直線上にあるとは限りません。これは、読み取られた配列をゲノムにマッピングし、それによってそれらの起源を特定するための特定の複雑さを与えます。トランスクリプトーム全体に適用される次世代シーケンシングの機能の詳細については、RNA-SeqおよびMicroRNASequencingを参照してください。

タンパク質シーケンシングを実行する方法は次のとおりです。

  • エドマン分解
  • ペプチドマスフィンガープリンティング
  • 質量分析
  • プロテアーゼダイジェスト

タンパク質をコードする遺伝子がわかっている場合、現在、DNAの配列を決定し、タンパク質の配列を推測する方がはるかに簡単です。上記の方法のいずれかによってタンパク質のアミノ酸配列の一部(多くの場合、一端)を決定することは、この遺伝子を保有するクローンを同定するのに十分である可能性があります。

けれども多糖類はまた、生体高分子あり、いくつかの理由のために、「シークエンシング」の多糖類を話をするので、一般的ではありません。多くの多糖類は線状ですが、多くは枝を持っています。多くの異なるユニット(個々の単糖)を使用し、さまざまな方法で結合することができます。ただし、主な理論的理由は、ここにリストされている他のポリマーが主に1つのプロセッシブ酵素によって「テンプレート依存」方式で生成されるのに対し、多糖類の各個々の結合は異なる酵素によって形成される可能性があるためです。多くの場合、アセンブリは一意に指定されていません。どの酵素が作用するかに応じて、いくつかの異なるユニットの1つを組み込むことができます。これにより、類似した分子のファミリーが形成される可能性があります。これは特に植物の多糖類に当てはまります。以下のための方法、構造決意のオリゴ糖と多糖は含まNMRのスペクトル分析およびメチル化分析。[5]

  • エクソームシーケンシング
  • 全ゲノムシーケンス
  • 遺伝コード
  • 病理遺伝学
  • RNA-Seq
  • マイクロRNAシーケンシング
  • 配列モチーフ

  1. ^ Wheeler、David A。; Srinivasan、Maithreyan; エグホルム、マイケル; シェン、ユフェン; チェン、レイ; マクガイア、エイミー; 彼、ウェン; Chen、Yi-Ju; Makhijani、Vinod(2008-04-17)。「超並列DNAシーケンシングによる個人の完全なゲノム」。自然452(7189):872–876。Bibcode:2008Natur.452..872W。土井:10.1038 / nature06884。ISSN  0028から0836まで。PMID  18421352。
  2. ^ ライフ2.0。(2006年8月31日)。エコノミスト
  3. ^ カールソン、ロバートH.生物学は技術です:エンジニアリングライフの約束、危険、そして新しいビジネス。マサチューセッツ州ケンブリッジ:ハーバード大学出版局、2010年。印刷
  4. ^ カールソン、ロバート(2003)。「生物学的技術のペースと増殖」。バイオセキュリティとバイオテロリズム:バイオディフェンスの戦略、実践、科学1(3):203–214。土井:10.1089 / 153871303769201851。PMID  15040198。
  5. ^ 炭水化物の構造分析への実用的なガイド