454ライフサイエンス

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454 Life Sciences、コネチカット州ブランフォードを拠点とするバイオテクノロジー企業であり、ハイスループットDNAシーケンシングを専門としています。生産は2016年半ばまで続いたものの、2007年にロシュに買収され、2013年にロシュが技術の競争力を失ったために閉鎖されました。[1]

454 Life Sciencesは、Jonathan Rothbergによって設立され、当初はCuraGenの子会社である454Corporationとして知られていました。低コストの遺伝子シーケンシングの方法により、454 Life Sciencesは、2005年にウォールストリートジャーナルのバイオテクノロジー-医療部門のイノベーションのための金メダルを受賞しました。[2] 454という名前は、プロジェクトが参照されたコード名でした。 CuraGen、および数字には既知の特別な意味はありません。[3]

2006年11月、Rothberg、マイケルEgholm、および454の同僚はとカバーの記事出版さスバンテ・ペーボ自然最初の100万記述した塩基対ネアンデルタール人ゲノムのを、そして開始ネアンデルタールゲノムプロジェクトを2009年までにネアンデルタール人のゲノムのシーケンスを完了すること。[4]

2007年3月下旬、ロシュダイアグノスティックスは454ライフサイエンスを1億5,490万米ドルで買収しました。[5]それは独立したビジネスユニットのままでした。[6] 2013年10月、ロシュは454をシャットダウンし、2016年半ばまでにプラットフォームのサポートを停止すると発表しました。[7]

2007年5月、454はプロジェクト「ジム」の結果を発表しました。これは、DNAの構造の共同発見者であるジェームズワトソンのゲノムの配列決定です。[8] [9]

454シーケンスでは、GS FLXTitaniumシリーズ試薬を使用してGenomeSequencer FLXで10時間実行するごとに約400〜600メガベースのDNAをシーケンスできる大規模な並列パイロシーケンスシステムを使用しました。[10]

このシステムは、噴霧され、アダプターがライゲーションされたDNAフラグメントを、油水型エマルジョン内の小さなDNAキャプチャービーズに固定することに依存していました。次に、これらのビーズに固定されたDNAをPCRで増幅しました。DNAに結合した各ビーズは、光ファイバーチップであるPicoTiterPlateの約29μmのウェルに配置されました。DNAポリメラーゼATPスルフリラーゼルシフェラーゼなどの酵素の混合物もウェルに詰め込まれました。次に、PicoTiterPlateをシーケンスのためにGSFLXシステムに配置しました。

454は、市場で最初の次世代DNAシーケンサーであるGS20シーケンスマシンを2005年にリリースしました。2008年、454SequencingはGenomeSequencerFLX機器で使用するGSFLX Titaniumシリーズ試薬を発売しました。これは、400〜500塩基対の読み取り長で1回の実行あたり4〜6億塩基対をシーケンスする機能を備えています。2009年後半、454 Life Sciencesは、Genome SequencerFLXシステムのベンチトップバージョンであるGSJuniorSystemを発表しました。[11]

DNAライブラリーの準備とemPCR

ゲノムDNAをより小さな断片(300〜800塩基対)に分画し、研磨しました(両端を鈍くしました)。次に、短いアダプターをフラグメントの端にライゲーションしました。これらのアダプターは、サンプルライブラリーフラグメントの増幅とシーケンスの両方にプライミングシーケンスを提供しました。1つのアダプター(アダプターB)には、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズにDNAライブラリーを固定化するための5'-ビオチンタグが含まれていました。ニック修復後、ビオチン化されていない鎖が放出され、一本鎖テンプレートDNA(sstDNA)ライブラリーとして使用されました。sstDNAライブラリーの品質を評価し、emPCRに必要な最適量(ビーズあたりのDNAコピー数)を滴定によって決定します。[12]

sstDNAライブラリーをビーズに固定化しました。ライブラリフラグメントを含むビーズは、単一のsstDNA分子を持っていました。ビーズに結合したライブラリーは、油中水混合物中の増幅試薬で乳化されました。各ビーズは、PCR増幅が行われる独自のマイクロリアクター内でキャプチャされました。これにより、ビーズで固定化され、クローン的に増幅されたDNAフラグメントが得られました。

シーケンス

一本鎖テンプレートDNAライブラリービーズをDNAビーズインキュベーションミックス(DNAポリメラーゼを含む)に加え、酵素ビーズ(スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを含む)とともにPicoTiterPlateデバイス上に重層しました。デバイスを遠心分離して、ビーズをウェルに沈着させた。酵素ビーズの層は、シーケンス反応中にDNAビーズがウェル内に配置されたままであることを保証しました。ビーズ沈着プロセスは、単一の増幅されたライブラリービーズを含むウェルの数を最大化するように設計されました。

ロードされたPicoTiterPlateデバイスは、Genome Sequencer FLXInstrumentに配置されました。フルイディクスサブシステムは、プレートのウェル全体にシーケンス試薬(バッファーとヌクレオチドを含む)を供給しました。シーケンシングの実行中に、4つのDNAヌクレオチドがPicoTiterPlateデバイス全体に一定の順序で順番に追加されました。ヌクレオチドの流れの間に、各ビーズに結合した何百万ものDNAのコピーが並行して配列決定されました。テンプレート鎖に相補的なヌクレオチドがウェルに追加されると、ポリメラーゼはヌクレオチドを追加することによって既存のDNA鎖を拡張しました。1つ(または複数)のヌクレオチドを追加すると、光信号が生成され、機器のCCDカメラによって記録されました。この手法は、合成によるシーケンスに基づいており、パイロシーケンスと呼ばれていました。[13]信号強度はヌクレオチドの数に比例していました。たとえば、単一ヌクレオチドフローに組み込まれたホモポリマーストレッチは、単一ヌクレオチドよりも大きなシグナルを生成しました。しかし、ホモポリマーストレッチのシグナル強度は、8連続ヌクレオチドまで直線的であり、その後、シグナルは急速に低下しました。[14]データは、ダウンストリーム分析のために標準フローグラム形式(SFF)ファイルで保存されました。

  • DNAシーケンシング

  1. ^ Hollmer、Mark(2013年10月17日)。「ロシュは、遺伝子シーケンシングの焦点を減らすため、454ライフサイエンスを閉鎖します」。激しいバイオテック
  2. ^ トッティ、マイケル(2005年10月24日)。「より良いアイデア」。ウォールストリートジャーナル
  3. ^ ポラック、アンドリュー(2003年8月22日)。「会社はそれが1日でウイルスの遺伝子をマッピングしたと言います」。ニューヨークタイムズ
  4. ^ グリーン、リチャードE。; クラウス、ヨハネス; Ptak、Susan E。; ブリッグス、エイドリアンW。; Ronan、Michael T。; シモンズ、ヤンF。; ドゥ、レイ; エグホルム、マイケル; ロスバーグ、ジョナサンM。; パウノビッチ、マヤ; ペーボ、スヴァンテ(2006年11月)。「ネアンデルタール人のDNAの100万塩基対の分析」。自然444(7117):330–336。土井:10.1038 / nature05336
  5. ^ 「アーカイブされたコピー」。2012年8月29日にオリジナルからアーカイブされました。2012年11月14日取得CS1 maint:タイトルとしてアーカイブされたコピー(リンク)
  6. ^ 「ロシュは買収で454のシーケンス技術をスネアします」。FierceBiotech。2007年3月28日。
  7. ^ 「454をシャットダウンするというロシュの決定に続いて、顧客は他のプラットフォームに移行する計画を立てます」。
  8. ^ ウィーラー、DA; Srinivasan、M。; Egholm、M。; シェン、Y。; チェン、L。; マクガイア、A。; 彼、W。; チェン、YJ; Makhijani、V。; ロス、GT; ゴメス、X。; Tartaro、K。; Niazi、F。; ターコット、CL; Irzyk、GP; ルプスキー、JR; Chinault、C。; 歌、X.-Z。; 劉、Y。; 元、Y。; ナザレ、L。; 秦、X。; Muzny、DM; マーガリーズ、M。; ワインストック、GM; ギブス、RA; Rothberg、JM(2008)。「超並列DNAシーケンシングによる個人の完全なゲノム」。自然452(7189):872–876。Bibcode:2008Natur.452..872W。土井:10.1038 / nature06884。PMID  18421352。
  9. ^ 「プロジェクトジム:ワトソンの個人ゲノムが公開される」。2008年11月21日にオリジナルからアーカイブされました。2007年6月16日取得
  10. ^ カール、V; etal。(2009)。「次世代シーケンシング:基礎研究から診断まで」。臨床化学55(4):41–47。土井:10.1373 /clinchem.2008.112789。PMID  19246620。
  11. ^ 「454LifeSciencesは、新しいベンチトップシーケンサーを発表しました。2010年の1,000 bp読み取りを含む、ゲノムシーケンサーFLXシステムの大幅な改善」(プレスリリース)。454ライフサイエンス。2009年11月19日。2011年11月15日のオリジナルからアーカイブ。2009年11月19日取得
  12. ^ 鄭、Z; etal。(2010)。「微量の出発物質を使用した滴定不要の超並列パイロシーケンス」。核酸解像度38(13):e137。土井:10.1093 / nar / gkq332。PMC  2910068。PMID  20435675。
  13. ^ キング、C; スコットホートン、T。(2008)。「パイロシーケンス:正確なジェノタイピングのための簡単な方法」。J Vis Exp(11)。土井:10.3791 / 630。PMC  2582836。PMID  19066560。
  14. ^ マーガリーズ、マルセル; Michael Egholm; 54人の追加の共著者(2005年9月15日)。「オープン微細加工高密度ピコリットルリアクターにおけるゲノム配列決定」。自然。ネイチャーパブリッシンググループ。437(7057):376–380。Bibcode:2005Natur.437..376M。土井:10.1038 / nature03959。PMC  1464427。PMID  16056220。